實時熒光定量PCR（qPCR）技術作為分子生物學領域中重要的實驗室儀器，已廣泛應用于各類生物學研究。然而，由于操作不當，許多研究人員在實驗中遇到了數(shù)據精度不高、重復性差、可信度差等問題。本文針對這些問題，從引物操作技巧、反應體系配制技巧、陰性對照技巧以及結果分析技巧四個方面，詳細介紹了使用熒光定量PCR儀時如何優(yōu)化qPCR實驗操作和數(shù)據分析，以提高實驗結果的準確性和可靠性。
一、引物的操作技巧
使用熒光定量PCR儀在進行qPCR實驗時，引物的設計至關重要。使用引物設計軟件進行設計時，需在操作界面上設定相應的參數(shù)，擴增子參數(shù)一般設定范圍為80～200bp。擴增子長度越短，擴增效率越高，可選擇設定在110bp。引物一般由試劑公司合成，為干粉狀態(tài)，在溶解前，最好用高速離心機低溫快速離心30s，使得引物干粉匯聚到管底，避免損失引物。收到引物后，需要先摸索引物的退火溫度和終濃度，以達到較理想的qPCR擴增效果，其次測定引物的擴增效率。
二、反應體系配制技巧
正式實驗時，每個樣本至少3個重復，為了消除各重復之間的系統(tǒng)誤差，將所需的所有試劑和模板加在同一個PCR管中，充分渦旋混勻后，再分裝到3個重復孔中，這樣可有效減小系統(tǒng)誤差。另外，建議使用20μL以上的反應體積，以消除由于加樣不準造成的系統(tǒng)誤差。
三、陰性對照的技巧
陰性對照一般是指用水代替模板的反應孔，體系中除了模板，包括了其他的反應組分。由于qPCR的高靈敏性，陰性對照有出現(xiàn)擴增信號的情況，那么在針對這類問題時，我們需要判斷其原因所在。使用染料法進行qPCR實驗時，首先查看陰性對照的溶解曲線主峰是否跟陽性孔的主峰位置一致。如果不一致，則可能是引物性能不好，無模板或使用低濃度模板下會出現(xiàn)引物二聚體，這種情況則需要考慮更換引物，保證引物特異性以及擴增效率。
四、結果分析的技巧
使用熒光定量PCR儀進行相對定量分析時，常用到的是2-ΔΔCq法，但是這種方法比較粗放，因為它的前提是假定所有引物的擴增效率都為100%。更為準確的定量則需要考慮不同引物擴增效率的差別。可先用梯度稀釋的模板測試各引物的擴增效率E，獲得實際擴增效率之后，后續(xù)實驗只需要在軟件中直接輸入擴增效率E值，即可計算更精準的相對定量值。
通過對qPCR技術中引物操作技巧、反應體系配制技巧、陰性對照技巧以及結果分析技巧的優(yōu)化，可以在很大程度上提高實驗結果的準確性和可靠性。
Q2000B熒光定量PCR儀采用目前進口半導體技術以及 MARLOW 半導體芯片制造商生產的半導體材料做為核心部件，確保產品的擴增速度、分析結果及系統(tǒng)可靠性，成為目前PCR行業(yè)的主流設備。它具備多項先進功能，其屏幕可90°調節(jié)，適應不同視角需求，確保了操作的便利性；同時，它通過同步熒光檢測減少了延時誤差，提高了數(shù)據準確性。設備自帶10英寸全真彩觸控屏，允許用戶直接在屏幕上編輯、查看和運行定量PCR及普通PCR程序，無需依賴電腦。采用新一代半導體升降溫技術，擁有高達6°C/SEC的變溫速率和100萬次循環(huán)的使用壽命。頂部檢測技術有效屏蔽背景干擾，提高熒光信號靈敏度和信噪比，兼容白管和透明管，確保結果的準確。此外，該還溫度梯度功能，便于優(yōu)化反應條件，并支持遠程操控，實時查看實驗數(shù)據及分析結果。另外，采用SSLPTM短光程靜態(tài)熒光CCD成像技術，保證了熒光信號的穩(wěn)定性和靈敏度。更多實驗室儀器請進入蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司網站咨詢。
