一、概述
熒光定量PCR儀是一種能夠定量測(cè)量DNA模板數(shù)量的實(shí)驗(yàn)設(shè)備，它通過(guò)利用特殊的熒光探針技術(shù)來(lái)檢測(cè)PCR反應(yīng)體系中目標(biāo)序列的擴(kuò)增情況。本文將著重介紹其技術(shù)原理、工作流程及應(yīng)用領(lǐng)域等方面。
二、技術(shù)原理
熒光定量PCR（qPCR）是在傳統(tǒng)PCR擴(kuò)增基礎(chǔ)上加入了熒光信號(hào)檢測(cè)模塊而發(fā)展出來(lái)的新型分子生物學(xué)方法。qPCR的開發(fā)使得我們可以更快地監(jiān)測(cè)和診斷感染性疾病，同時(shí)也可應(yīng)用于其他多樣化領(lǐng)域中。
其基本原理為：在PCR反應(yīng)體系中添加一個(gè)雙鏈DNA片段所對(duì)應(yīng)序列位置上引物，該引物含有兩個(gè)相互抵消的非共價(jià)結(jié)合螺旋橋段，并連接一個(gè)局部菲羅顯色組分；當(dāng)綁定到拷貝數(shù)目足夠多時(shí)，則會(huì)放射出強(qiáng)烈穩(wěn)定可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)的帶譜突峰信號(hào)，并最大限度降低背景雜訊產(chǎn)生率，從而提高數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性和靈敏度。通常，熒光定量PCR可以分為TaqMan法、SYBRGreen法等多種技術(shù)實(shí)現(xiàn)方式。
三、工作流程
1.樣品制備：將待測(cè)的DNA分子從樣本中提取出來(lái)，并加入適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)體系緩沖液中進(jìn)行純化和檢測(cè)處理。
2.PCR反應(yīng)配置：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，在熒光定量PCR儀上設(shè)置好所需擴(kuò)增的DNA序列及引物、孵育溫度、放大周期等參數(shù)。然后，按照設(shè)定步驟依次向每個(gè)試管內(nèi)加入合適數(shù)量的DNA模板及其他反應(yīng)成分，保證其在特定條件下能夠完成目標(biāo)擴(kuò)增過(guò)程。
3.執(zhí)行PCR循環(huán)程序：通過(guò)精確控制熒光信號(hào)計(jì)數(shù)器在不同時(shí)間點(diǎn)或溫度下發(fā)射出來(lái)信號(hào)波動(dòng)幅度大小值，在整個(gè)PCR循環(huán)過(guò)程中持續(xù)監(jiān)測(cè)并記錄下被放大產(chǎn)生物質(zhì)（如靶基因）相對(duì)于背景雜訊之間的比例關(guān)系。同時(shí)，結(jié)合前期已有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)信息和概率模型推演算法，可以快速準(zhǔn)確地估算出樣品原始含量并輸出相應(yīng)結(jié)果報(bào)告。
四、應(yīng)用領(lǐng)域
由于qPCR技術(shù)具有高靈敏性、高特異性、快速等優(yōu)點(diǎn)，因此已廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)臨床檢測(cè)、病毒檢測(cè)、食品安全監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。同時(shí)，在生物科學(xué)研究中也可以利用qPCR技術(shù)來(lái)分析基因表達(dá)水平、評(píng)估DNA修復(fù)能力和藥物代謝度等問(wèn)題，有助于推動(dòng)相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展。
