SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳實(shí)驗(yàn)步驟

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理：

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS（十二烷基硫酸鈉）， SDS會(huì)與變性的多肽，并使蛋白帶負(fù)電荷，由于多肽結(jié)合SDS的量幾乎總是與多肽的分子量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此SDS多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與1.4g去污劑結(jié)合。

當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線(xiàn)性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上求得分子量。

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳常用試劑及設(shè)備

試劑：蛋白值樣品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%過(guò)硫酸，5×SDS-PAGE電泳緩沖液，考馬斯亮藍(lán)R-250染色液，脫色液、天能預(yù)制膠。

儀器耗材：垂直電泳槽，電泳儀，電泳儀電源，移液槍?zhuān)埔簶宼ip吸頭，離心管、試劑瓶。

實(shí)驗(yàn)步驟

一、凝膠配置

1．分離膠的配制

（1）找出配套的膠板，用擦鏡紙擦干凈，并固定在配膠器上。隨后用去離子水試漏；

（2）若膠板不漏水，就進(jìn)行分離膠的配制。依次將水、30%丙烯酰胺、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中，混勻（1mm的膠板，一般配一塊膠用5ml。所配的膠濃度一般為12%，但濃度也要視情況而定。蛋白越小，膠的濃度越大）；

（3）將膠板中的水倒掉，并用濾紙吸干水分（不要將濾紙塞到膠板底部）；

（4）小燒杯中再加入TEMED，混勻。（TEMED可使膠凝固，所以最后加）；

（5）灌膠：混勻的分離膠沿著膠板邊緣輕輕灌下，防止產(chǎn)生氣泡；

（6）用水將分離膠壓平（用水灌滿(mǎn)，同時(shí)加水時(shí)要緩慢加入，防止把膠吹起）。

也可以直接使用預(yù)制膠，預(yù)制膠直接拆開(kāi)即用，不用配制。

2．濃縮膠的配制

（1）待分離膠與水中間形成明顯的橫線(xiàn)，即分離膠凝固。隨后進(jìn)行濃縮膠的配制，依次將水、30%丙烯酰胺、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過(guò)硫酸銨加到干凈的小燒杯中；

（2）將分離膠上層的水倒掉，并用濾紙吸干水分（盡量不要把濾紙插入）；

（3）小燒杯中再加入TEMED，混勻；

（4）灌膠。然后插入梳子；

（5）把制膠器倒過(guò)來(lái)，膠仍然不會(huì)往外流，或可以明顯看出梳子中兩個(gè)齒之間的膠面明顯凹下去，說(shuō)明濃縮膠凝固。將凝固的膠板裝入電泳槽內(nèi)，并在電泳槽內(nèi)加入SDS-PAGE電泳緩沖液，把膠浸泡一段時(shí)間，時(shí)間越長(zhǎng)越好（防止梳子與膠相連，或膠因濕度不夠而縮減）；

（6）點(diǎn)樣時(shí)，再把梳子拔出來(lái)，拔時(shí)動(dòng)作要輕，防止膠齒被拔斷。

二、SDS-PAGE電泳步驟

1、調(diào)膠：拔掉SDS膠上的梳子，并用小針調(diào)整齒的位置（使它們都平行）。

2、點(diǎn)樣：用20µL的小槍頭，吸煮過(guò)的樣品10µL，對(duì)準(zhǔn)膠孔點(diǎn)樣，注意不要把樣品點(diǎn)在外面。使用適當(dāng)?shù)姆肿恿康鞍譵arker。

3、電泳：電泳儀正負(fù)極接好，打開(kāi)電源。濃縮膠：電壓 low 100V，分離膠：電壓 high 150V。

4、卸膠：等膠內(nèi)的所有的藍(lán)色都跑出去，電泳停止，一般時(shí)間為1-2小時(shí)左右。把膠板從電泳儀上卸下，用刀片把膠板撬開(kāi)，膠的濃縮膠部分割除；

5、染色：放入考馬斯亮藍(lán)R-250染色液中進(jìn)行常溫過(guò)夜染色；

5、脫色：將過(guò)夜染色的SDS-PAGE膠放入脫色液中進(jìn)行脫色，直到背景發(fā)白。

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