乳酸是CHO細(xì)胞補(bǔ)料分批培養(yǎng)的主要副產(chǎn)品之一。在 pH 控制的生物反應(yīng)器中， 由于添加堿以控制細(xì)胞培養(yǎng)基的 pH值，高水平乳酸的積累伴隨著高滲透壓，可能導(dǎo)致制造細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，甚至大量凋亡，同時(shí)產(chǎn)生抗體蛋白的產(chǎn)量也降低不少。而 乳酸脫氫酶 (LDH) 是一種催化底物丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的酶，包括丙酮酸濃度在內(nèi)的許多因素都會(huì)調(diào)節(jié) LDH 活性。
乳酸脫氫酶對(duì)代謝產(chǎn)物的影響
在一項(xiàng)研究中，科學(xué)家們?cè)鴩L試敲低乳酸脫氫酶 A (LDHa) 和 PDHK 的基因表達(dá)，以研究對(duì)乳酸代謝和蛋白質(zhì)生產(chǎn)的影響。他們發(fā)現(xiàn)，使用攜帶 LDHa 和 PDHK 的小抑制性 RNA (siRNA) 的單個(gè)靶向載體，可以成功地同時(shí)下調(diào) LDHa 和 PDHK。此外，他們使用 siRNA 介導(dǎo)的 LDHa/PDHKs 敲低克隆的分批補(bǔ)料搖瓶評(píng)估數(shù)據(jù)顯示，在表達(dá)治療性單克隆抗體的 CHO細(xì)胞中下調(diào) LDHa 和 PDHKs會(huì)減少乳酸產(chǎn)量，增加比生產(chǎn)率和體積 抗體產(chǎn)量分別減少約 90%、75% 和 68%，對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)沒(méi)有明顯影響。從在生物反應(yīng)器中進(jìn)行的評(píng)估中也觀察到 siRNA 克隆平均較低乳酸水平和較高抗體生產(chǎn)率的類似趨勢(shì)。
降低CHO細(xì)胞培養(yǎng)中的乳酸水平的方法
生物制藥蛋白質(zhì)產(chǎn)品市場(chǎng)正在快速增長(zhǎng)，在2010年時(shí)已經(jīng)達(dá)到 700 億美元。由于對(duì)功能性蛋白質(zhì)的需求增加，需要開(kāi)發(fā)技術(shù)以實(shí)現(xiàn)更高的生產(chǎn)率。為實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)，已經(jīng)在 CHO細(xì)胞中探索了包括宿主細(xì)胞工程在內(nèi)的不同方法。CHO 細(xì)胞廣泛用于生產(chǎn)治療性蛋白質(zhì)，包括在具有受控 pH 值的生物反應(yīng)器中使用分批補(bǔ)料工藝生產(chǎn)重組單克隆抗體。乳酸是補(bǔ)料分批培養(yǎng)過(guò)程中積累的主要副產(chǎn)物之一，已表明高乳酸水平會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和蛋白質(zhì)生產(chǎn)。 生物反應(yīng)器中葡萄糖乳酸指標(biāo)分析一般使用EKF Biosen C-Line 乳酸分析儀來(lái)在線測(cè)定，培養(yǎng)過(guò)程中多數(shù)選用通過(guò)調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的堿度的方式來(lái)維持適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的PH環(huán)境。但是，乳酸分泌和向培養(yǎng)基中增加堿這兩者都會(huì)導(dǎo)致滲透壓增加，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并導(dǎo)致抗體生產(chǎn)率降低。因此，降低乳酸水平對(duì)于開(kāi)發(fā)穩(wěn)健且高效的抗體生產(chǎn)過(guò)程是可取的。乳酸分泌和向培養(yǎng)基中增加堿以維持 pH 值會(huì)導(dǎo)致滲透壓增加，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并導(dǎo)致抗體生產(chǎn)率降低。因此，降低乳酸水平對(duì)于開(kāi)發(fā)穩(wěn)健且高效的抗體生產(chǎn)過(guò)程是可取的。乳酸分泌和向培養(yǎng)基中增加堿以維持 pH 值會(huì)導(dǎo)致滲透壓增加，從而抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并導(dǎo)致抗體生產(chǎn)率降低。因此，降低乳酸水平對(duì)于開(kāi)發(fā)穩(wěn)健且高效的抗體生產(chǎn)過(guò)程是可取的。
有許多因素會(huì)影響哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸生成，包括丙酮酸的細(xì)胞內(nèi)濃度。丙酮酸是 LDH 和 PDH 的底物，是決定消耗的碳源是通過(guò)糖酵解氧化后作為乳酸排出還是在 TCA 循環(huán)中進(jìn)一步代謝的關(guān)鍵分支點(diǎn)。LDH 在催化丙酮酸和乳酸轉(zhuǎn)化的同時(shí)也催化 NADH 和 NAD+ 的相互轉(zhuǎn)化。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，LDH 以同源或異源四聚體的形式存在，主要由 LDHa 和 LDHb 基因編碼的 A 和 B 亞基組成。在 CHO 細(xì)胞中，LDH 同種型已被證明是 A3B 和 A2B2 四聚體的中間體。
PDH 復(fù)合體活性的調(diào)節(jié)方法
PDH 復(fù)合體是一種多酶單位，由三種催化酶 E1、E2 和 E3 組成。該復(fù)合物催化將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A 的限速反應(yīng)，乙酰輔酶 A 是三羧酸 (TCA) 循環(huán)的入口點(diǎn)。PDH 的活性受 PDHK 和丙酮酸脫氫酶磷酸酶 (PDHP) 的調(diào)節(jié)。PDHK 磷酸化 PDH 以抑制其酶活性，而 PDHP 去磷酸化并因此激活 PDH 酶活性。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有四種 PDHK 同種型：PDHK1、PDHK2、PDHK 3 和 PDHK4。這些同種型中的每一種都具有不同的組織特異性分布。由于 LDHa 和 PDHKs 的表達(dá)都可以影響丙酮酸水平，并且之前已經(jīng)表明敲低 LDHa 表達(dá)可以降低乳酸水平，他們假設(shè)如果他們同時(shí)減少 LDHa 和 PDHKs 的表達(dá)CHO 細(xì)胞中，更多的丙酮酸可能會(huì)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶 A，從而增加這些細(xì)胞中 TCA 循環(huán)產(chǎn)生的能量。因此，LDHa 和 PDHK 的下調(diào)可能不僅會(huì)導(dǎo)致乳酸減少，還會(huì)導(dǎo)致 CHO 細(xì)胞中抗體產(chǎn)量增加。
在這項(xiàng)研究中，他們證明了使用單個(gè) siRNA 靶向載體可以同時(shí)降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 的表達(dá)。當(dāng)他們同時(shí)降低 LDHa 和 PDHK1、2 和 3 基因表達(dá)，使用EKF Biosen C-Line 乳酸分析儀進(jìn)行乳酸分析后，發(fā)現(xiàn)不僅乳酸水平大幅降低，抗體產(chǎn)量居然也增加了不少。
構(gòu)建靶向 LDHa 和 PDHK1、2、 3 的載體
LDHa 的靶向序列是根據(jù) Kim 和 Lee 的論文選擇的，LDHa siRNA 序列是 CTCGATTCCGTTATCTGAT。為了設(shè)計(jì) PDHK 的 siRNA 靶向序列，CHO PDHK1、2 和 3 的部分 cDNA 序列通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (RT-PCR) 克隆，引物位于 PDHK 的高度保守區(qū)域內(nèi)，部分克隆的序列也用于 siRNA 序列設(shè)計(jì)。
構(gòu)建靶向 PDHKs 和 LDHa 的 siRNA 載體
在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中報(bào)道了四種 PDHK 基因 。為了確定是否所有四種 PDHK 基因都在 CHO細(xì)胞中表達(dá)，基于人和小鼠 PDHK 序列之間的保守區(qū)域設(shè)計(jì)了四組 RT-PCR 引物。 PCR 結(jié)果顯示，即使在 CHO 細(xì)胞中可以檢測(cè)到所有四種 PDHK mRNA，但 PDHK4 mRNA 水平低，并且遠(yuǎn)低于 DHFR 缺陷型 CHO 細(xì)胞中的其他 3 種 PDHK（數(shù)據(jù)未顯示）。
實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，單獨(dú)降低 LDHa 基因表達(dá)能夠減少乳酸的產(chǎn)生。然而，盡管乳酸水平降低了 45-79%，但 Qp 和產(chǎn)物滴度沒(méi)有明顯改善，這表明在 CHO 細(xì)胞中單獨(dú)敲低 LDHa 不足以有效提高 Qp 和產(chǎn)物產(chǎn)量。
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