一、實驗目的：通過本實驗學習瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的方法和技術。 二、實驗原理 DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時有電荷效應和分子篩效應。DNA分子在高于等電點的pH溶液中帶負電荷在電場中向正極移動。由于糖－磷酸骨架在結構上的重復性質，相同數量的雙鏈DNA幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即DNA分子本身的大小和構型。具有不同的相對分子質量的DNA片段泳動速度不一樣，可進行分離。DNA分子的遷移速度與相對分子質量對數值成反比關系。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質量的DNA， 也可以分離相對分子質量相同，但構型不同的DNA分子。如質粒有3種構型：超螺旋的共價閉合環(huán)狀質粒DNA(covalently closed circμLar DNA，簡稱 CCCDNA)；開環(huán)質粒DNA，即共價閉合環(huán)狀質粒DNA 1條鏈斷裂，（open circμLar DNA， 簡稱OCDNA）；線狀質粒DNA ，即共價閉合環(huán)狀質粒DNA 2條鏈發(fā)生斷裂，（linear DNA，簡稱L DNA）。這3種構型的質粒DNA分子在凝膠電泳中的遷移率不同。因此電泳后呈3條帶，超螺旋質粒DNA泳動最快，其次為線狀DNA和開環(huán)質粒DNA。 三、主要試劑 瓊脂糖、溴酚藍、TE、TAE、EB、DNA marker. 1. 10 x TAE (10倍體積的TAE儲存液) 配 1000mL 50 ×TAE：Tris 242g，冰乙酸57.1mL，0.5 mol/L EDTA 100 mL pH8.0 2. 凝膠加樣緩沖液（6×）：溴酚藍0.25％，蔗糖40％ 3. 瓊脂糖（1%）：稱1g瓊脂糖，放入250 mL三角瓶內，加入100 mL 1×TAE電泳緩沖液，加熱煮沸等其冷至60℃左右，倒入封好的電泳板上。 4. 溴化乙錠溶液 (EB) 0.5 μg /mL，置棕色瓶避光保存。 四、儀器耗材 電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、移液槍一套、微波爐。 五、實驗步驟 1. 制備瓊脂糖凝膠：稱取0.1g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入10mL 1×TAE緩沖液，至微波爐加熱至溶化，取出搖勻，則為1％的瓊脂糖凝膠液。 2. 膠板的制備：取有機玻璃內槽，洗凈晾干。將有機玻璃內槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。 3. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機玻璃內槽，直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。待膠凝固后，取出梳子，放在電泳槽內。加入電泳緩沖液至電泳槽中。 4. 加樣：將樣品5μL與上樣緩沖液1μL混合，用移液槍將該混合樣品加入樣品孔（記錄點樣順序及點樣量）。同時加入DNA marker作為對照。 5. 電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負極，DNA片段從負極向正極移動）。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5 V/cm。 當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1～2cm處，停止電泳。 6. 染色：將電泳后的凝膠浸入溴化乙錠染色液（0.5mg/mL）中，染色10min（戴手套操作）。 7. 觀察：在紫外燈下觀察凝膠中的條帶（戴手套操作），并記錄拍照。 8. 有EB的凝膠要放到專用的垃圾袋中作專門處理，以免污染環(huán)境（戴手套操作）。 六、注意事項 1．EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必須經專門處理后才能清洗或丟棄。 2．當EB太多，膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡后再觀察。 3．電泳時注意導線正負極，防止接反。 蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司14年專注于凝膠電泳設備，生物實驗室儀器設備和生物試劑、PCR耗材、細胞培養(yǎng)耗材供應。 |
