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生命科學研究中常用的幾種實驗方法

 更新時間:2023-02-06 點擊量:1263

生命科學研究時生物學的分支,下面介紹幾個關(guān)于生命科學常用的幾種實驗方法:
一、BCA法測蛋白質(zhì)濃度

實驗原理:BCA(bicinchoninic acid,二辛可酸)法測定蛋白質(zhì)即在堿性條件下蛋白質(zhì)與Cu2+絡(luò)合,并將其還原成Cu1+。Cu1+和BCA試劑反應(yīng)使其由原來的蘋果綠形成穩(wěn)定的紫藍色復(fù)合物,在562 nm有強烈的光吸收,且吸光值和蛋白質(zhì)濃度在廣泛范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系,因此可用于蛋白質(zhì)濃度測定。

二、免疫組化

原理:免疫組織化學,即免疫組化,是應(yīng)用免疫學基本原理一-抗原抗體反應(yīng),即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,通過化學反應(yīng)使標記抗體的顯色劑(熒光素、翻、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原《多肽和蛋白質(zhì)),對其進行定位、定性及定量的研究。常用于免疫組化實驗的有組織石蠟切片、組織冰凍切片、細胞爬片或細胞涂片。

三、RNA提取(Trizol法)

Trizol試劑中的主要成分為異硫氰酸胍和苯酚,其中異硫氰酸胍可裂解細胞,促使核蛋白體的解離,使RNA與蛋白質(zhì)分離,并將RNA釋放到溶液中。當加入氯仿時,它可抽提酸性的苯酚,而酸性苯酚可促使RNA進入水相,離心后可形成水相層和有機層,這樣RNA與仍留在有機相中的蛋白質(zhì)和DNA分離開。水相層(無色)主要為RNA,有機層(黃色)主要為DNA和蛋白質(zhì)。

四、RT-PCR

RT-PCR是將RNA的反轉(zhuǎn)錄(RT)和cDNA的聚合酶鏈式擴增(PCR)相結(jié)合的技術(shù)。首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶的作用從RNA合成 cDNA,再以cDNA為模板,擴增合成目的片段。RT-PCR可以一步法或兩步法的形式進行。在兩步法RT-PCR中,每一步都在最佳條件下進行。

實驗步驟主要包括:1、RNA的提??;2、反轉(zhuǎn)錄合成cDNA;3、PCR擴增;4、產(chǎn)物的電泳和結(jié)果的測定。

五、實時熒光定量PCR(Q—PCR)(Real-time Quantitative PCR )

利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化,通過Ct值和標準曲線的關(guān)系對起始模板進行定量分析。

閾值:是循環(huán)開始3~15個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍,設(shè)定在擴增曲線指數(shù)增長期。

C(t)值:熒光信號(擴增產(chǎn)物)到達閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。
 

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