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細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題匯總

 更新時(shí)間:2023-02-02 點(diǎn)擊量:949
細(xì)胞培養(yǎng)常見(jiàn)問(wèn)題匯總

1 冷凍管應(yīng)如何解凍?取出冷凍管后,須立即放入 37 C 水槽中快速解凍,輕搖冷凍管使其在 1 分鐘內(nèi)全部融化,并注意水面不可超過(guò)冷凍管蓋沿,否則易發(fā)生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時(shí),必須注意安全,預(yù)防冷凍管之爆裂。

2 細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),是否應(yīng)馬上去除 DMSO?除少數(shù)特別注明對(duì) DMSO 敏感之細(xì)胞外,絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),在解凍之后,應(yīng)直接放入含有 10-15ml 新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除 DMSO 即可,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。

3 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基?不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng),造成細(xì)胞無(wú)法存活。

4 可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類?不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,所以血清的種類和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活。

5 何謂 FBS, FCS, CS, HS ?FBS (fetal bovine serum) 和 FCS (fetal calf serum) 是相同的意思,兩者都是指胎牛血清, FCS 乃錯(cuò)誤的使用字眼,請(qǐng)不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)應(yīng)使用 5 %或 10% CO2?或根本沒(méi)有影響?一般培養(yǎng)基中大都使用 HCO3-/CO32-/H+ 作為 pH 的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中 NaHCO3 的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用的 CO2 濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 含量為每公升 3.7 g 時(shí),細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)應(yīng)使用 10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中 NaHCO3 為每公升 1.5 g 時(shí),則應(yīng)使用 5% CO2 培養(yǎng)細(xì)胞。

7 何時(shí)須更換培養(yǎng)基?視細(xì)胞生長(zhǎng)密度而定,或遵照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之更換時(shí)間,按時(shí)更換培養(yǎng)基即可。

8 培養(yǎng)基中是否須添加抗生素?除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

9 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用之 trypsin-EDTA 濃度?應(yīng)如何處理?一般使用之 trypsin-EDTA 濃度為 0.05% trypsin-0.53m MEDTA.4Na。第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于–20 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成 trypsin 之活性降低,并可減少污染之機(jī)會(huì)。

10 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何繼代處理?一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時(shí),可將培養(yǎng)角瓶口端稍微抬高,直到無(wú)法容納為止。分瓶時(shí)取出一部份含細(xì)胞之培養(yǎng)液至另一新的培養(yǎng)角瓶,加入新鮮培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)濃度,重復(fù)前述步驟即可。

11 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來(lái),其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速?欲回收動(dòng)物細(xì)胞,其離心速率一般為 300xg (約1,000rpm),5 - 10分鐘,過(guò)高之轉(zhuǎn)速,將造成細(xì)胞死亡。

12 細(xì)胞之接種密度為何?依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)之一重要原因。

13 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含 5 - 10% DMSO(dimethyl sulfoxide) 和 90 - 95 %原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意:由于 DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,故不可將 DMSO直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成。

14 DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何?冷凍保存使用之 DMSO 等級(jí),必須為 Tissue culture grade 之 DMSO(如 Sigma D2650),其本身即為無(wú)菌狀況,第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,保存于 4 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成 DMSO 之裂解而釋出有害物質(zhì),并可減少污染之機(jī)會(huì)。若要過(guò)濾 DMSO,則須使用耐DMSO 之 Nylon 材質(zhì)濾膜。

15 冷凍保存細(xì)胞之方法?冷凍保存方法一:冷凍管置于 4 C 30~60 分鐘 → (-20 C 30 分鐘) → -80 C 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降 1-3 C 至–80 C 以下, 再放入液氮槽 vapor phase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存。*-20 C 不可超過(guò) 1 小時(shí),以防止冰晶過(guò)大,造成細(xì)胞大量死亡,亦可跳過(guò)此步驟直接放入-80 C 冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

16 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為 1x106 cells/ml vial,融合瘤細(xì)胞則以 5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染?細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o(wú)菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染之血清和污染之細(xì)胞等。嚴(yán)格無(wú)菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好之細(xì)胞來(lái)源和培養(yǎng)基配制是減低污染的好方法。

18 如果細(xì)胞發(fā)生微生物污染時(shí),應(yīng)如何處理?加入相應(yīng)抗生素,直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細(xì)胞, 是否能以肉眼觀察出異狀?不能。除極有經(jīng)驗(yàn)之專家外,大多數(shù)遭受支原體污染的細(xì)胞株,無(wú)法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會(huì)對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)有何影響?支原體污染幾乎可影響所有細(xì)胞之生長(zhǎng)參數(shù),代謝及研究任一數(shù)據(jù)。故進(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,必須確認(rèn)細(xì)胞為 mycoplasma-free,實(shí)驗(yàn)結(jié)果之?dāng)?shù)據(jù)方有意義。

21 偵測(cè)出細(xì)胞株有支原體污染時(shí), 該如何處理?直接滅菌后丟棄,以避免污染其它細(xì)胞株。

22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?定期(至少每?jī)芍芤淮? 以無(wú)菌蒸餾水或無(wú)菌去離子水更換之。

23 為何培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,顏色會(huì)偏暗紅色,且pH值會(huì)越來(lái)越偏堿性?培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中,培養(yǎng)基內(nèi)之CO2會(huì)逐漸溢出,造成培養(yǎng)基越來(lái)越偏堿性,而培養(yǎng)基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會(huì)隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿之結(jié)果,將造成細(xì)胞生長(zhǎng)停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時(shí),可以通入無(wú)菌過(guò)濾之CO2,以調(diào)整pH 值。

24 各種細(xì)胞培養(yǎng)用的 dish,flask 是否均相同?不同廠牌的 dish 或 flask,其所 coating 的 polymer 不同,制造程序亦不同,雖對(duì)大部分細(xì)胞沒(méi)有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之 dish 或 flask 而有顯著之生長(zhǎng)差異。

25 購(gòu)買之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形?研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,造成細(xì)胞的物理性損傷,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

26 購(gòu)買之細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳可能原因?研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)存活率不佳,常見(jiàn)原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯(cuò)誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯(cuò)誤或血清的品質(zhì)不佳。解凍過(guò)程錯(cuò)誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯(cuò)誤。細(xì)胞置于–80℃太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂,瓶蓋有裂紋,或瓶蓋脫落之原因?冷凍管瓶蓋裂紋,或瓶身破裂,可能是因?yàn)椴僮髡邐A取冷凍管時(shí)用力不當(dāng),造成冷凍管裂損,建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動(dòng)或松脫,乃因熱脹冷縮之物理現(xiàn)象,冷凍管有可能因此而造成細(xì)胞污染,故冷凍管于放入和取出液氮桶時(shí),均應(yīng)立刻將冷凍管再一次扭緊。

28 如何選用特殊細(xì)胞系培養(yǎng)基?培養(yǎng)某一類型細(xì)胞沒(méi)有固定的培養(yǎng)條件。在 MEM 中培養(yǎng)的細(xì)胞,很可能在DMEM 或M199 中同樣很容易生長(zhǎng)??傊?, MEM 做粘附細(xì)胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細(xì)胞培養(yǎng)是一個(gè)好的開(kāi)始,各種目的無(wú)血清培養(yǎng)可選 AIMV(12005)培養(yǎng)基(SFM)。

29 L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎?它在溶液中不穩(wěn)定嗎?L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解,但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性。

30 GlutaMAX-I 是什么?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用 GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定?GlutaMAX-I二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用 L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎降解完成。

31 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅?酚紅在培養(yǎng)基中被用來(lái)作為 PH 值的指示劑:中性時(shí)為紅色,酸性時(shí)為黃色,堿性時(shí)為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用,(特別是雌激素)。為避免固醇類反應(yīng),培養(yǎng)細(xì)胞,尤其是哺乳類細(xì)胞時(shí),用不加酚紅的培養(yǎng)基。由于酚紅干擾檢測(cè),一些研究人員在做流式細(xì)胞檢測(cè)時(shí),不使用加有酚紅的培養(yǎng)基。

32 培養(yǎng)基中丙酮酸鈉的作用是什么?丙酮酸鈉可以作為細(xì)胞培養(yǎng)中的替代碳源,盡管細(xì)胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒(méi)有葡萄糖的話,細(xì)胞也可以代謝丙酮酸鈉。

33 目錄上說(shuō),Hank’s平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要CO2培養(yǎng)箱。原因是什么?Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和 Earle’s平衡鹽溶液(EBS)有什么本質(zhì)的功能差別?HBS和EBS的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,在Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L)中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO2平衡,以維持溶液的 PH 值。Eagles 液在空氣水平的CO2中,溶液會(huì)變堿,Hanks液在CO2培養(yǎng)箱中會(huì)變酸。如果希望在CO2培養(yǎng)箱中保存組織,需要用 Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細(xì)胞培養(yǎng)基中儲(chǔ)存的組織,用Hanks液就可以了。

34 二價(jià)離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時(shí)加入EDTA的目的是什么?二價(jià)離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來(lái)螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來(lái)自培養(yǎng)基中所有的二價(jià)離子。

35 當(dāng)在無(wú)血清培養(yǎng)基中添加抗生素時(shí),降低至少在有血清培養(yǎng)基中所使用濃度的 50%。血清蛋白會(huì)結(jié)合和滅活一些抗生素。在無(wú)血清培養(yǎng)條件下,抗生素不被滅活,可能對(duì)于細(xì)胞達(dá)到毒性水平。

36 一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時(shí),您應(yīng)該在兩到三周內(nèi)使用它。因?yàn)橐恍┛股睾脱逯械幕境煞衷诮鈨龊缶烷_(kāi)始降解。

37 大部分添加物和試劑最多可以凍融 3 次,如果次數(shù)更多都會(huì)在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,將會(huì)影響它的性能。

38 在溶解的一周內(nèi)使用貯存在 4℃冰箱中的液體胰蛋白酶溶液。胰蛋白酶在 4℃就可能開(kāi)始降解,如果在室溫下放置超過(guò) 30 分鐘,就會(huì)變得不穩(wěn)定。

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