熒光定量pcr常見(jiàn)問(wèn)題的可能原因與解決方案
無(wú)Ct值或Ct值延遲出現(xiàn):擴(kuò)增曲線信號(hào)不佳，曲線不平滑:標(biāo)準(zhǔn)曲線線性差。
1.擴(kuò)增產(chǎn)物大小不合適：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度通常在80-150 bp之間，如果調(diào)整反應(yīng)的時(shí)間有可能擴(kuò)增500bp的片段。
2.PCR反應(yīng)過(guò)程中退火及延伸的時(shí)間過(guò)短或過(guò)長(zhǎng)：應(yīng)根據(jù)擴(kuò)增片段的大小予與調(diào)整。
3.MgCl,濃度不合適：按0. 5mm的間距調(diào)整MgCI2的濃度。
4.循環(huán)數(shù)設(shè)置不足：最少設(shè)置35個(gè)循環(huán)，可以增加到45個(gè)循環(huán)。超過(guò)45個(gè)循環(huán)以上背景信號(hào)會(huì)增加，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析造成干擾。
5.在錯(cuò)誤的PCR反應(yīng)步驟采集信號(hào)：應(yīng)檢查程序設(shè)置確保信號(hào)的采集是在退火的步驟進(jìn)行的。
6.加樣的誤差及錯(cuò)誤：注意每次加樣的一致性及移液器的校正。
7.DNA模板的起始濃度過(guò)低，不能被檢測(cè)出來(lái)：如果模板的濃度未知，最初的實(shí)驗(yàn)可以采用較高濃度的模板并進(jìn)行梯度稀釋。最高的模板濃度不超過(guò)500ng基因組DNA。
8.模板DNA的降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲(chǔ)存條件是否合適，如果確認(rèn)降解應(yīng)重新制備新鮮的DNA模板。
9.梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)樣品的方法不規(guī)范:應(yīng)注意梯度稀釋樣品的操作規(guī)范，準(zhǔn)確。
10.引物或探針設(shè)計(jì)有誤，存在二級(jí)結(jié)構(gòu)：通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)熒光定量PCR反應(yīng)結(jié)果，是否有PCR產(chǎn)物存在。如果沒(méi)有PCR擴(kuò)增產(chǎn)品，應(yīng)使用引物設(shè)計(jì)軟件檢查引物的各種指標(biāo)是否合適: Tm. 與模板的批配度、 二級(jí)結(jié)構(gòu)、擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度、非特異型擴(kuò)增的情況。具體的數(shù)據(jù)請(qǐng)翻閱前面的相關(guān)原理說(shuō)明
11.引物之間的Tm值相差過(guò)多：上下游引物的Tm值差不應(yīng)超過(guò)4C。
12.引物或探針的使用濃度不合適：應(yīng)將濃度控制在50- 900 nM之間，探針的濃度低于引物的濃度。
13.引物或探針降解：使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA模板是否降解，檢查DNA模板的儲(chǔ)存條件是否合適，如果確認(rèn)降解應(yīng)重新制備新鮮的DNA模板。
14.探針設(shè)計(jì)的位置在擴(kuò)增片段的5’端：應(yīng)將探針設(shè)計(jì)的位置靠近擴(kuò)增片段的3”端
15.探針被氧化：避免用酸性溶液溶解探針，否則會(huì)產(chǎn)生高背景熒光信號(hào)及低的擴(kuò)增信號(hào)。推薦的緩沖液是pH8.0的TE緩沖液中。
