在進(jìn)行定量PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中的C t值是至關(guān)重要的。今天將帶您了解 Ct值在 qPCR 中的關(guān)鍵作用、及其計(jì)算方式和分析統(tǒng)計(jì)方法。
C t值多重名稱
在我們深入解釋什么是 Ct 值之前，我們想花點(diǎn)時(shí)間強(qiáng)調(diào)一下，多年來(lái)該值已被賦予多個(gè)名稱，包括：
C t – 閾值循環(huán)
C p – 交叉點(diǎn)
TOP——起飛點(diǎn)
C q – 量化周期
這些值都是一樣的，只是名稱不同。為了規(guī)范qPCR的命名法，一般標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)中會(huì)使用Cq值。
什么是 C q值？
定量PCR實(shí)驗(yàn)通常用于量化目標(biāo)序列的絕對(duì)量或比較樣本之間目標(biāo)序列的相對(duì)量。該技術(shù)通過(guò)放大過(guò)程中發(fā)出的目標(biāo)特異性熒光信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)目標(biāo)的擴(kuò)增。
盡管實(shí)時(shí)熒光定量PCR中， 熒光染料和探針 應(yīng)該是序列特異性的，但在大多數(shù)實(shí)時(shí) PCR 實(shí)驗(yàn)中會(huì)出現(xiàn)大量的背景熒光。通過(guò)閾值線和 C t值可以輕松分析背景中的熒光信號(hào)，了解 PCR的循環(huán)周期。其實(shí)，所謂的閾值線是檢測(cè)水平或反應(yīng)達(dá)到高于背景水平的熒光強(qiáng)度的點(diǎn)。在進(jìn)行 PCR 之前，您（或您的 PCR 儀中的軟件）設(shè)置了一個(gè)閾值水平。這實(shí)際上是圖表中的一條線，代表高于背景熒光的水平，它也在指數(shù)階段開(kāi)始時(shí)與反應(yīng)曲線相交（圖 1）。
C q值是您的樣品反應(yīng)曲線與閾值線相交處的 PCR 循環(huán)數(shù)。該值表明從您的樣本中檢測(cè)到真實(shí)信號(hào)需要多少個(gè)周期。實(shí)時(shí) PCR 運(yùn)行將具有每個(gè)樣品的反應(yīng)曲線，因此會(huì)有許多 C q 值。您的 PCR 儀軟件會(huì)計(jì)算 每個(gè)樣品的 Cq值并繪制圖表。
(實(shí)時(shí) PCR 擴(kuò)增曲線上的閾值水平和 C q 值)
C q 值與樣本中目標(biāo)核酸的數(shù)量成反比，并與樣本中的目標(biāo)拷貝數(shù)相關(guān)。較低的 C q值（通常低于 29 個(gè)循環(huán)）表示大量的目標(biāo)序列。較高的 C q 值（超過(guò) 38 個(gè)循環(huán)）意味著較低的目標(biāo)核酸量。高 C q值也可能表明目標(biāo)或 PCR 設(shè)置存在問(wèn)題，如本文后面的陷阱部分所述。
您的 PCR 儀器將在每個(gè)循環(huán)中收集熒光數(shù)據(jù)。大約 15 個(gè)循環(huán)后，您將對(duì)背景熒光水平有一個(gè)很好的了解 ——這將顯示為一條從零循環(huán)點(diǎn)開(kāi)始的直線。閾值水平將剛好高于此水平，但在您的樣品開(kāi)始進(jìn)入 PCR 擴(kuò)增指數(shù)階段時(shí)。今天，計(jì)算機(jī)軟件可以計(jì)算出這個(gè)確切的點(diǎn)，所有現(xiàn)代實(shí)時(shí)循環(huán)儀都有一個(gè)自動(dòng)閾值線設(shè)置。
實(shí)時(shí) PCR 記錄反應(yīng)過(guò)程中發(fā)出的熒光量，此時(shí)所有 PCR 成分都非常豐富。這樣，C q 值通常在實(shí)時(shí) PCR 中的重復(fù)之間保持一致。當(dāng)達(dá)到 PCR 反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)，積累的抑制劑、失活的聚合酶和限制性試劑會(huì)在終點(diǎn)值上產(chǎn)生很多變化，這就是傳統(tǒng) PCR 無(wú)法定量使用的原因。
影響Cq值的相關(guān)因素有哪些？
許多因素會(huì)影響您的 C q 值。 您的樣品之間C q 值的一些差異將是由于生物事件，例如您的目標(biāo)基因響應(yīng)治療而上調(diào)/下調(diào)。然而，C q 值同樣容易受到 PCR 反應(yīng)準(zhǔn)備和 PCR 組分本身的影響。比較常見(jiàn)的是以下幾種情況：
1. 主混音
溶液中的 pH 值和鹽濃度會(huì)影響熒光發(fā)射。熒光發(fā)射的任何變化都會(huì)自然地改變您的 C q值。因此，請(qǐng)確保您只使用高質(zhì)量的 PCR 組件，如果使用自制溶液，請(qǐng)?jiān)诿看螌?shí)驗(yàn)前檢查 pH 值并監(jiān)測(cè)鹽沉淀。
2. 被動(dòng)參考染料
反應(yīng)值是您的 FAM（報(bào)告基因）染料與您的 ROX（被動(dòng)參考）染料的熒光比率。假設(shè) FAM 熒光不變，較低量的 ROX 會(huì)產(chǎn)生較高的反應(yīng)值。
3. 反應(yīng)效率
PCR 反應(yīng)效率取決于預(yù)混液性能、引物的特異性、引物退火溫度和樣品質(zhì)量。一般來(lái)說(shuō)，90% 以上的 PCR 效率是可以接受的。* 的 PCR 效率表明感興趣的目標(biāo)序列在每個(gè)循環(huán)中加倍。 PCR 效率與模板 10 倍稀釋之間 3.3 個(gè)循環(huán)的變化相吻合。
要確定每個(gè)引物對(duì)的 PCR 效率，請(qǐng)使用五個(gè) 10 倍稀釋步驟對(duì)模板進(jìn)行系列稀釋，并計(jì)算 R 2 ，這是一種描述一個(gè)值預(yù)測(cè)另一個(gè)值的統(tǒng)計(jì)量度。對(duì)于接近 100% 的 PCR 效率，您的 R 2 值應(yīng)大于 0.99。
對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線上的每個(gè)點(diǎn)至少運(yùn)行三個(gè)重復(fù)。對(duì)于低拷貝數(shù)輸入，更高的重復(fù)數(shù)尤其重要，因?yàn)橹貜?fù)數(shù)之間的變化更有可能發(fā)生。
4. 其他問(wèn)題
假設(shè)您已經(jīng)排除了上述 3 個(gè)因素，導(dǎo)致 C q 值晚的常見(jiàn)原因可能是：
模板太少 - 嘗試使用更多模板。
次優(yōu)的核酸分離——考慮您的核酸分離方案，量化您的 DNA，運(yùn)行瓊脂糖凝膠，嘗試其他方案/ 試劑盒。
cDNA 合成過(guò)程中逆轉(zhuǎn)錄酶活性較差——逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)降解敏感。訂購(gòu)一個(gè)新的。
RNA/cDNA 降解——保持您的工作空間清潔，改善您的RNA 處理行為 ，避免 cDNA 的多次凍融循環(huán)。
PCR抑制。
另外，其他原因也同樣會(huì)影響定量PCR 的Cq值，包括細(xì)胞系/培養(yǎng)物中的感染或污染，但這些問(wèn)題通常在核酸分離之前被發(fā)現(xiàn)。更多PCR相關(guān)問(wèn)題可以進(jìn)入蘇州阿爾法生物實(shí)驗(yàn)器材有限公司進(jìn)行咨詢或留言。
