如何選擇基因測(cè)序方法

當(dāng)今的主要技術(shù)基因測(cè)序技術(shù)相對(duì)成熟，DNA測(cè)序的主要方法有Sanger 測(cè)序、下一代測(cè)序 (NGS) 和長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序。如何選擇基因測(cè)序方法。以下是對(duì)這些方法、優(yōu)缺點(diǎn)和重要標(biāo)準(zhǔn)的簡(jiǎn)要回顧，可幫助您權(quán)衡下一個(gè)測(cè)序選擇。

選擇測(cè)序方法的標(biāo)準(zhǔn)

選擇測(cè)序方法的標(biāo)準(zhǔn)很多，取決于研究人員及其項(xiàng)目的性質(zhì)。正在研究的生物學(xué)問(wèn)題是關(guān)鍵。Pacific Biosciences 副總裁 Jonas Korlach 說(shuō)：“研究的背景決定了使用哪種類(lèi)型的測(cè)序，因?yàn)椴煌臏y(cè)序方法具有不同的特征來(lái)推動(dòng)選擇。"

常見(jiàn)的標(biāo)準(zhǔn)包括測(cè)序時(shí)間、通量、成本和準(zhǔn)確度——所有這些往往會(huì)相互影響。“準(zhǔn)確性、成本和數(shù)據(jù)吞吐量之間的動(dòng)態(tài)一直是測(cè)序技術(shù)選擇的驅(qū)動(dòng)因素，在不犧牲準(zhǔn)確度的情況下，成本和通量的提高推動(dòng)了 DNA 測(cè)序?qū)V泛的應(yīng)用。"

測(cè)序?qū)嶒?yàn)室成本主要包括購(gòu)買(mǎi)儀器費(fèi)用、實(shí)驗(yàn)室試劑耗材費(fèi)用、樣本數(shù)量、計(jì)劃外包測(cè)序及測(cè)序前的準(zhǔn)備步驟。還有另一個(gè)值得考慮的因素是要測(cè)序的目標(biāo)的大小，這會(huì)也影響測(cè)序時(shí)間和成本。

測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的讀取長(zhǎng)度也可能會(huì)影響決策，因?yàn)?/span>其中一些些應(yīng)用需要較長(zhǎng)的讀取長(zhǎng)度。比如：NGS 產(chǎn)生MIN讀長(zhǎng)（約 50-500 bp），其次是 Sanger 測(cè)序（約 500-1000 bp），然后是長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序（約 5-30 kb）。

桑格測(cè)序

Sanger 測(cè)序是一項(xiàng)久經(jīng)考驗(yàn)的技術(shù)，對(duì)于少量樣本來(lái)說(shuō)簡(jiǎn)單快速，能夠解析單個(gè)堿基對(duì)。它在摻入放射性標(biāo)記的核苷酸類(lèi)似物后通過(guò)鏈終止起作用。然后通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離得到的 基因片段以進(jìn)行鑒定。Sanger 方法對(duì)包含重復(fù)和二級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜 DNA 區(qū)域很有幫助，并且通常被用作驗(yàn)證 NGS 檢測(cè)到的遺傳變異的正交方法。

但是，與 NGS 相比，Sanger 測(cè)序的通量較低，因此可能不適合大型項(xiàng)目。Sanger 測(cè)序可以對(duì)較小的 DNA 區(qū)域、一小組基因以及通常少于 1000 個(gè)樣本進(jìn)行高準(zhǔn)確的測(cè)序。

事實(shí)上，對(duì)于較小范圍的項(xiàng)目，使用 Sanger 基因 測(cè)序方法進(jìn)行靶向或聚焦測(cè)序的項(xiàng)目時(shí)間、成本和復(fù)雜性要低得多，通常使用的是細(xì)管電泳法，即：在毛細(xì)管電泳儀器上的毛細(xì)管內(nèi)使用 Sanger 測(cè)序化學(xué)，有助于查明基因片段中的單個(gè)堿基。

新一代測(cè)序

測(cè)序目標(biāo)的會(huì)嚴(yán)重影響到測(cè)序方法的選擇。Sanger 測(cè)序適合少量基因或短基因組片段。NGS 測(cè)序發(fā)則適合用于 大面積的基因組或全基因組測(cè)序。 與使用 Sanger 測(cè)序相比，NGS 測(cè)序法具有高通量的特點(diǎn)可以使大型項(xiàng)目快速、容易、低成本地進(jìn)行完成測(cè)序。所以NGS 是全基因組測(cè)序、全外顯子組測(cè)序、分析大型基因組、檢測(cè)稀有變異以及發(fā)現(xiàn)和診斷的較為理想的選擇。然而，對(duì)于靶向測(cè)序，NGS 可能比 Sanger 貴。同時(shí)，NGS 所使用的 NGS 測(cè)序儀，儀器成本較高，而且NGS 工作流程比 Sanger 測(cè)序更復(fù)雜，

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序

   在長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序中，基因片段在穿過(guò)納米孔時(shí)單獨(dú)測(cè)序（Oxford Nanopore Technologies），或者在單個(gè)小孔中復(fù)制。較長(zhǎng)的重疊序列使組裝更容易，就像用更少的大塊拼圖拼圖，而不是 NGS 中更多的小塊。其他優(yōu)點(diǎn)包括消除了擴(kuò)增偏差，并且可以更容易地檢測(cè)到大插入/缺失、重復(fù)區(qū)域等特征。長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序的錯(cuò)誤率可能高于 NGS，但持續(xù)的技術(shù)改進(jìn)正在縮小準(zhǔn)確度的差距。